Metoda MPN Untuk Analisa Escherichia Coli Pada Air Dan Air Limbah

Apakah anda ingin melakukan analisa Escherichia coli pada air dan air limbah?

Salah satu metode analisa yang bisa kita lakukan adalah metode analisa 9221B Teknik Standar Fermentasi Total Coliform (MPN) yang terdapat pada American Public Health Association (APHA) edisi 23. 

I. Persiapan Alat Dan Bahan

1. Tabung reaksi

2. Pipet ukur

3. Inkubator

4. Autoclave

Bagaimana melakukan Kalibrasi dan Uji Kinerja Pada Autoclave? + Free Template Formulir Uji Kinerja Autoclave

5. Bunsen

7.  Lauryl Tryptose Broth (LTB)

8. Brilliant Green Lactose Broth (BGLB)

9.  EC Broth

10. MUG EC Broth

11. MacConkey Agar (MCA)

12. Pewarnaan Gram

II. Persiapan Sampel

Volume sampel yang digunakan :

1.Air Minum

Untuk sampel air minum dapat disiapkan sejumlah volume 100 ml (10 ml sebanyak 10 ulangan atau 20 ml sebanyak 20 ulangan, atau 100 ml sebanyak 1 ulangan)

2. Selain Air Minum

Ketika menganalisis selain air minum, inokulasikan pengulangan tabung dengan jumlah pengenceran yang sesuai.

Gunakan 5 tabung disetiap pengenceran, misalnya :

Volume (ml) 10 1 0,1 0,01 0,001
Pengenceran 101 100 10-1 10-2 10-3

3.Sampel yang lainnya

Teknik ini bisa digunakan pada Air laut, lumpur, maupun sedimen.

Untuk sampel padatan/ semisolid :

  • Sampel ditimbang kemudian ditambahkan pelarut hingga pengencerannya 0,1
  • Contoh : ditimbang 30 gram sampel kemudian dimasukkan ke dalam wadah steril kemudian ditambahkan 270 ml buffer posfat steril atau 0,1% air peptone dan dihomogenkan kurang lebih 1-2 menit pada kecepatan 8000 rpm.

Pengenceran dan jumlah sampel yang dipipet mengacu pada APHA 9215B.2

III. Prosedur Kerja

A.Tahap Pendugaan (Tahap Awal)

1. Media LTB (Lauryl Tryptose Broth) sebanyak 10 ml dituangkan ke dalam tabung ulir yang telah berisi durham

2. Sampel dihomogenkan (dikocok 5 detik)

3. Tiap-tiap tabung berisi LTB ditambahkan sampel sesuai dengan volume yang telah ditentukan

4. Kemudian diinkubasi pada suhu (35 ± 0,5) oC selama (24 ± 2) jam

5. Jika hasil positif (+), maka akan terbentuk adanya gas atau bayangan berwarna kuning.

6. Jika hasil negatif (-), maka tidak terbentuk adanya gas dan bisa dilakukan inkubasi ulang kemudian dibaca pada (48±3) jam

B. Tahap Konfirmasi

1. Siapkan media sesuai dengan pengujian yang akan dilakukan (BGLBB untuk Total Coliform, ECB untuk Fecal Coliform, dan EC MUG untuk coli) sebanyak 10 ml tiap tabung

2. Hasil positif diambil sebanyak 1 ose lalu diinokulasikan pada media spesifik tiap uji

3. Lakukan inkubasi :

BGLBB pada suhu (35 ± 0,5) oC selama (48 ± 3) jam

EC MUG (44,5 ± 0,2) oC  selama (24 ± 2) jam

EC Broth (44,5 ± 0,2) oC  selama (24±2) jam

4. Jika hasil positif (+), maka akan terbentuk adanya gas

5. Jika hasil negatif (-), maka tidak terbentuk adanya gas

Tahap Alternatif untuk Air Limbah

1. Jika ada sampel pada media LTB yang seluruh tabungnya positif semua setelah diinkubasi 24 jam. Maka, untuk fase konfirmasi hanya diuji pengenceran yang terbesar (jumlah volume terkecil)

2. Hasil positif diambil sebanyak 1 ose lalu diinkubasikan pada media spesifik (BGLBB untuk Total Coliform, ECB untuk Fecal Coliform, dan EC MUG untuk coli) tiap uji

3. Larutan diinkubasi pada suhu yang sesuai selama (24-48) jam

4. Jika hasil positif (+), maka akan terbentuk adanya gas

Jika hasil negatif (-), maka tidak terbentuk adanya gas

C. Tahap Penyelesaian (Tidak diperlukan untuk air minum)

1. Media agar disiapkan terlebih dahulu dalam cawan petri

2. Hasil positif dari tahap konfirmasi diinokulasikan pada media LES Endo agar atau MCA dengan menggoreskan/streak pada agar

3. Dilakukan inkubasi pada suhu (35 ± 0,5) oC selama (24 ± 2) jam

Ciri hasil positif pada media LES Endo Agar, menghasilkan koloni khas berwarna pink sampai merah tua dengan warna hijau metalik di permukaan

Ciri hasil positif pada media MCA, menghasilkan koloni khas berwarna merah dan seperti ada zona buram

4. Kemudian hasil positif dari media LES Endo Agar maupun MCA diinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam satu tabung media LTB (Single strength) dan NA miring.

5. Jika tidak ada koloni khas, maka dapat memilih 2 atau lebih koloni yang dianggap paling memungkinkan untuk

6. Untuk LTB, lakukan inkubasi pada suhu (35 ± 0,5) oC selama (24 ± 2) jam. Jika tidak ada gas yang terbentuk setelah inkubasi selama (24 ± 2) jam maka dilakukan reinkubasi selama (48 ± 3) jam

7. Untuk NA diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi selama 24 jam selanjutnya dilakukan Pewarnaan Gram

8. Selanjutnya dilakukan Pewarnaan Gram.

9. Cara melakukan pewarnaan gram :

10. Pada kaca objek digores tipis hasil positif inokulasi kemudian dilakukan fiksasi. selanjutnya ditambahkan kristal violet dan didiamkan selama 1 menit . kemudian dibilas dengan air mengalir kemudian ditambahkan lugol dan didiamkan selama 1 menit.

11. Kemudian dilakukan dekolorisasi (penghilangan warna) menggunakan alkohol dan didiamkan 15 sampai 30 detik. kemudian ditambahkan safranin dan didiamkan selama 15 detik lalu dibilas dengan air mengalir.

12. Kemudian diserap airnya menggunakan kertas penyerap atau lainnya.

13. Kemudian hasil pewarnaan diamati menggunakan mikroskop.

14. Untuk hasil gram positif berwarna biru. Untuk gram negatif berwarna merah. hasil diterima jika kontrol memberikan hasil yang sesuai.

 

Demikian informasi yang bisa kami sampaikan tentang Metoda MPN Untuk Analisa Escherichia Coli Pada Air Dan Air Limbah, Jika ada informasi lain yang dibutuhkan, Silahkan menghubungi kami 0821-2429-3839 atau klik

Klik untuk menghubungi Team LabMania

Leave a reply